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研究速览-eccDNA 2023年最新进展大放送！

游离于染色体基因组之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被发现常常以环状的形式存在，这种形式的DNA被称为环状DNA (extrachromosomal circular DNA，eccDNA）。目前也习惯将巨大的环状DNA(>1Mb)称为ecDNA, 而将相对较小的环状DNA称为eccDNA。

染色体外环状DNA是一种环状双链DNA分子，广泛存在于各种生物体内，最早于1965年由Alix Bassel和Yasuo Hotta发现并报道。但受限于当时的科学技术，eccDNA的研究起步较晚。近年来，随着高通量测序技术和生物信息学的飞速发展，科学界对eccDNA的形成和功能有了新的认识。

那今年eccDNA研究领域又有哪些新进展呢？

云序生物为您汇总了今年的高分文章，快跟随云序生物一起看一看eccDNA领域都有什么新发现吧！

疾病类

1、HPV整合产生细胞超级增强子，作为ecDNA调节全基因组转录

文章标题：HPV integration generates a cellular super-enhancer which functions as ecDNA to regulate genome-wide transcription

发表期刊：Nucleic Acids Research（IF=14.9）

文章链接：https://academic.oup.com/nar/article/51/9/4237/7067948?login=false

人乳头瘤病毒（HPV）整合是宫颈癌发生发展的关键步骤；然而，人们对全基因组转录水平的致癌机制仍然知之甚少。在本研究中，作者对六种HPV阳性细胞系和三种HPV阴性细胞系的多组学数据进行了整合分析。通过HPV整合检测、超级增强子（SE）鉴定、SE相关基因表达和染色体外DNA（ecDNA）研究，探索HPV整合对全基因组转录的影响。作者共鉴定出七种由HPV整合产生的高级细胞SE（HPV断点诱导细胞SE，BP-cSEs），它们导致染色体内和染色体间对染色体基因的调控。通路分析表明，失调的染色体基因与癌症相关通路相关。重要的是，作者证明了 BP-cSEs 存在于 HPV-人杂交的 ecDNA 中，从而解释了上述转录变化。研究结果表明，HPV整合产生的细胞SEs具有ecDNA的功能，可调控不受约束的转录，从而扩展了HPV整合的致瘤机制，并为开发新的诊断和治疗策略提供了启示。

BP - cSEs可作为ecDNA染色质调控染色体基因

2、染色体外DNA或可驱动巴雷特食管的癌变

文章标题：Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett’s oesophagus

发表期刊：Nature（IF=64.8）

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05937-5

染色体外DNA（ecDNA）上的癌基因扩增推动了肿瘤的进化和抗药性，并与癌症患者的不良预后有关。目前，尚不清楚ecDNA是基因组不稳定性的后期表现，还是从发育不良转变为癌症的早期事件。为了更好地了解ecDNA 的发展，作者分析了食管腺癌（EAC）或巴雷特食管患者的全基因组测序（WGS）数据。这些数据包括剑桥大学巴雷特食管监测和 EAC 队列中的206 例活检。还分析了弗雷德-哈钦森癌症中心病例对照研究中80名患者在两个时间点采集的多个区域活检的 WGS 和组织学数据。在剑桥队列中，ecDNA的频率在巴雷特食管相关早期EAC（24%）和晚期EAC（43%）之间增加，这表明 ecDNA 是在癌症进展过程中形成的。在弗雷德-哈钦森癌症中心（Fred Hutchinson Cancer Center）的队列中，33%的 EAC 患者在确诊 EAC 之前或确诊 EAC 时至少有一次食道活检发现了 ecDNA。在癌症诊断前收集的活检样本中，后来患上EAC的患者样本中的 ecDNA 含量高于未患EAC的患者样本中的含量。研究发现，ecDNA包含多种多样的致癌基因和免疫调节基因。此外，在疾病的晚期，ecDNA的拷贝数和结构复杂性都有所增加。研究结果表明，ecDNA可在高度发育不良到癌症的早期转变中发展，并且ecDNA 会在正向选择下逐步形成和进化。

ecDNA与恶性转化

3、揭示编码miR-17-92的eccDNA在肝癌发生发展中的重要作用

文章标题：Extrachromosomal circular MiR-17-92 amplicon promotes hepatocellular carcinoma

发表期刊：Hepatology（IF=13.5）

文章链接：https://journals.lww.com/hep/Abstract/9900/Extrachromosomal_circular_MiR_17_92_amplicon.416.aspx

染色体外环状DNA（eccDNA）在癌症基因组中很普遍，并作为一类关键但特征较少的致癌驱动因素出现。然而，eccDNA在肝细胞癌（HCC）中的结构，组成，全基因组频率和贡献仍未得到探索，肝细胞癌是最致命和最常见的癌症之一。在这项研究中，作者提供了人类HCC中eccDNA的全面表征，并证明了含有microRNA-17-92的eccDNA在肿瘤进展中的致癌作用。作者使用Circle测序方法，鉴定并表征了来自四对HCC肿瘤和邻近非肿瘤肝组织样本的230,000多个eccDNA。EccDNA在HCC肿瘤中高度富集，优先起源于某些染色体热点，并与差异基因表达相关。特别是，通过outward PCR和sanger测序验证了一系列携带microRNA-17-92簇的eccDNA。定量PCR分析显示，含有microRNA-17-92的eccDNA及其相应的microRNA的表达在HCC肿瘤中升高，并且与肝细胞癌患者的不良结局和年龄有关。更耐人寻味的是，通过连接酶辅助的微环积累法合成的含有miR-17-92簇的人工DNA环的外源表达可以显着加速HCC细胞的增殖和迁移。这些发现描绘了HCC的全基因组eccDNA谱，并强调了含microRNA的eccDNA在肿瘤发生中的功能意义，为HCC发病机制和癌症治疗以及eccDNA和microRNA生物学提供了见解。

含有miR-17-92簇的eccDNA在人类HCC肿瘤中富集

4、PLCG2可存在于eccDNA中，通过调节线粒体呼吸，促进非小细胞肺癌的转移

文章标题：PLCG2 can exist in eccDNA and contribute to the metastasis of non-small cell lung cancer by regulating mitochondrial respiration

发表期刊：Cell Death & Disease（IF=16.6）

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41419-023-05755-7

染色体外环状DNA（eccDNA）参与肿瘤发生和发展。然而，eccDNA在非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用和机制尚未阐明。在本研究中，使用三种匹配的NSCLC组织样本，NSCLC细胞系（H1299，A549和H460）和正常肺细胞系（MRC-5）作为研究对象。通过高通量eccDNA测序和生物信息学分析，研究eccDNA表达的分布模式和表达水平。通过常规PCR验证上调的候选ecc DNA编码的PLCG2。通过质粒转染、RNA干扰、qRT-PCR和Western印迹实验来验证PLCG2的表达水平。结果显示，NSCLC组和正常组的eccDNA在染色体分布、长度分布和基因组注释方面具有差异。然而，NSCLC组织与匹配的正常肺组织之间的eccDNA并无明显差异。PLCG2来源的eccDNA在NSCLC细胞中表达上调。TCGA分析和免疫组化显示PLCG2在肺癌组织中高表达，并倾向于与不良预后相关。我们还证明了PLCG2 可通过调节线粒体呼吸促进转移。这些结果表明，通过eccDNA测序鉴定的PLCG2具有癌基因的作用，可能成为NSCLC诊断和预后评估的新生物标记物。

图 eccDNA在NSCLC细胞转移中的作用及机制示意图

5、基于eccDNA分布特征，建立三阶段模型可指导胶质瘤的精确临床诊断和治疗

文章标题：A three-stage eccDNA based molecular profiling significantly improves the identification, prognosis assessment and recurrence prediction accuracy in patients with glioma

发表期刊：Cancer Letters（IF=9.7）

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.canlet.2023.216369

胶质母细胞瘤（GBM）的进展受瘤内异质性的影响。越来越多的证据强调了染色体外环状DNA（eccDNA）在加速肿瘤异质性方面的关键作用，尤其是在GBM中。然而，GBM中的eccDNA图谱尚未阐明。在本研究中，作者首先利用来自相同样本的circle-Seq和RNA测序数据确定了GBM和邻近组织的eccDNA图谱。根据在mRNA水平上表现出一致的上调和下调趋势的 eccDNA 携带基因，建立了一个三阶段模型。为了提高三阶段模型的性能和稳健性，研究人员结合使用了机器学习算法和堆叠集合模型在第一阶段，共构建了113种机器学习算法组合，并在多个外部队列中进行了验证，以准确区分胶质瘤患者中的低级别胶质瘤（LGG）和GBM。所有队列中AUC最大的模型被选中进行可解释性分析。在第二阶段，共建立并验证了101种机器学习算法组合，用于胶质瘤患者的预后预测。该预后模型在多个胶质瘤队列中表现良好。复发性 GBM 总是与侵袭性和难治性疾病相关。因此，准确预测复发风险对于制定个体化治疗策略、监测患者状态和改善临床管理至关重要。在第三阶段，作者利用大规模的 GBM 队列（包括原发性和复发性 GBM 样本）来拟合 GBM 复发预测模型。通过拟合多个机器学习和堆叠集合模型，选出性能最佳的模型。最后，开发了一个网络工具，以促进三阶段模型的临床应用。

eccDNA与RNA测序流程

6、小eccDNA可作为多癌症诊断和检测生物标志物

文章标题：Small extrachromosomal circular DNAs as biomarkers for multi-cancer diagnosis and monitoring

发表期刊：Clinical and Translational Medicine（IF=10.6）

文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ctm2.1393

小染色体外环状DNA (eccDNA)具有成为癌症生物标志物的潜力。然而，在癌变过程中小eccDNA的形成机制和功能尚不清楚，癌症患者血浆中的小ecccDNA谱是否代表癌组织中的小eccDNA谱仍有待阐明。本研究采用基于纳米孔测序平台的新型测序工作流程，对收集自25例癌症患者(包括前列腺癌、肝细胞癌和结直肠癌)的组织和独立验证队列(其中癌症血浆7份,健康血浆14份)的血浆中的天然存在的全长小eccDNA进行测序。研究发现，与非癌组织相比，癌组织中检测到的小eccdna数量和大小均显著增加，且分布更加均匀，形成机制也不同。尽管小eccdna在癌症组织和配对血浆之间具有不同的一般特征和基因组注释，但它们具有相似的形成机制和癌症相关功能。来源于某些特定基因的小eccDNA在组织（AUC>=0.8）和血浆（AUC>0.9）中具有很大的多癌诊断价值，特别是提高了CEA/CA19-9水平对多癌预测的准确性。ALK&ETV6来源的小eccDNA的高多癌诊断价值，可以从组织(AUC= 0.804)外推到血浆，并在验证队列中显示出较高的阳性预测值(100%)和阴性预测值(82.35%)。因此作为独立且稳定的环状DNA分子，组织和血浆中的小eccDNAs可作为理想的生物标志物，用于经济有效的多癌症诊断和监测。

研究路线

7、eccDNA在妇科肿瘤和生殖中重要作用

文章标题：Innovative insights into extrachromosomal circular DNAs in gynecologic tumors and reproduction

发表期刊：Protein & Cell（IF=21.1）

文章链接：https://doi.org/10.1093/procel/pwad032

染色体外环状DNAs ( eccDNAs )起源于染色体DNA，但游离于染色体DNA之外，以环状形式组织，在单细胞和多细胞真核生物中早已被发现。人们对它们的起源和功能知之甚少，因为它们与线性DNA具有序列同源性，因此可用的检测方法很少。近年来，高通量测序技术的发展揭示了eccDNA在肿瘤形成、进化、耐药以及衰老、基因组多样性等生物学过程中发挥着至关重要的作用，使其重新成为研究热点。eccDNA的形成有多种机制被提出，包括断裂-融合-桥( BFB )和易位-缺失-扩增模型。妇科肿瘤和胚胎及胎儿发育障碍是人类生殖健康的主要威胁。自首次在猪精子中发现eccDNA和在卵巢癌腹水中发现双微体以来，eccDNA在这些病理过程中的作用已被部分阐明。本文综述了eccDNAs的研究历史、生物起源以及现有的检测和分析方法，阐明了其在妇科肿瘤和生殖中的作用。作者还提出将eccDNAs作为药物靶标和液体活检标志物应用于产前诊断和妇科肿瘤的早期发现、预后和治疗，为今后研究eccDNAs在重要生理和病理过程中的复杂调控网络奠定了理论基础。

eccDNA的功能

机制类

1、Nature揭示eccDNA形成之谜!

文章标题：Retrotransposons hijack alt-EJ for DNA replication and eccDNA biogenesis

发表期刊：Nature（IF=64.8）

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06327-7

逆转座子的激活可改写宿主DNA信息，从根本上影响宿主生物学。尽管逆转座子的发育激活可为宿主带来益处，如抵御病毒感染，但失控的激活会促进疾病或可能导致老化。激活后,逆转录转座子利用其mRNA作为模板合成双链DNA，以便在宿主基因组中进行新的插入。虽然它们编码的反转录酶可以合成第一链DNA，但第二链DNA是如何生成的，目前仍不清楚。本研究报告了逆转座子劫持宿主的可变末端连接（alt-EJ）DNA修复过程中的环化步骤来合成第二链DNA。作者通过Nanopore测序研究了复制的逆转座子DNA的命运，发现10 %的逆转座子DNA实现了新的插入，而90 %的逆转座子DNA以染色体外环状DNA ( eccDNA )的形式存在。alt - EJ通过环化过程驱动长末端重复逆转座子DNA的第二链合成，是eccDNA产生和新插入所必需的。该研究明确了环状 DNA 在逆转座子复制中的核心作用，颠覆了此前人们认为逆转座子复制过程中产生的环状 DNA 是复制失败的副产物，论文指出，这些环状DNA并非无用的副产物，它们可能促使mRNA启动新一轮的复制，也可能插入到基因组重塑基因信息，环状DNA还能成为诱导先天免疫的重要分子，介导其潜在的免疫调节作用。

阻断alt - EJ过程，HMS - Beagle细胞的DNA合成和所有eccDNA的产生均被阻断

2、研究人员揭示eccDNA植物表观遗传调控机制

文章标题：Extrachromosomal circular DNA and structural variants highlight genome instability in Arabidopsis epigenetic mutants

发表期刊：Nature communications（IF=16.6）

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41023-0

丰富的染色体外环状DNA (eccDNA )与转座因子( TE )活性相关。然而，ecc DNA是如何受到表观遗传调控的，以及其对基因组的影响尚缺乏研究。在本研究中，作者利用long reads对受DNA甲基化和转录后基因沉默的拟南芥突变体植株的eccDNA区室和基因组进行了测序。检测到高载量的TE来源的截短和嵌合形式的eccDNA。在基因组方面，除了截短和全长的TE新插入外，还在抗病簇中检测到复杂的结构变异( SV )，这是SV的一个自然热点。最后，作者意外地在低甲基化的植物中发现了大量的串联重复，表明SV可能在表观遗传突变体中被忽视了。作者认为，至少在植物中，eccDNA的高负荷可能会改变DNA修复途径，导致基因组不稳定和SV的积累。

在拟南芥表观遗传突变体中检测到总体基因组不稳定性

数据库

1、eccDNAs数据库— eccDNA Atlas

文章标题：eccDNA Atlas: a comprehensive resource of eccDNA catalog

发表期刊：BRIEFINGS IN BIOINFORMATICS（IF=9.5）

文章链接：https://doi.org/10.1093/bib/bbad037

染色体外的环状DNA ( eccDNA )是一大类非线粒体、非质粒的染色体外环状DNA，在肿瘤发生、免疫反应、液体活检等方面发挥着不可或缺的作用。然而，eccDNA的特征和功能信息是碎片化的，隐藏在丰富的文献和海量的全基因组测序( WGS )背后的数据，尚未被充分用于eccDNA的鉴定。

因此，建立一个综合的资源库对于鉴定和分析eccDNAs至关重要。在本研究中，作者开发了eccDNA Atlas ( http://lcbb.swjtu.edu.cn/eccDNAatlas)，这是一个用户友好型的的eccDNAs数据库，旨在为浏览、搜索和分析来自多个物种的eccDNAs提供一个高质量的综合资源。目前，eccDNA Atlas了包含从文献中查阅到的629987个eccDNAs和8221个ecDNAs，以及AmpliconArchitect基于WGS数据预测的1105个ecDNAs，涉及66种疾病、57种组织和319个细胞系。每个eccDNA条目的内容包括序列、疾病、功能、特征、验证策略等多个方面。此外，eccDNA Atlas还提供了丰富的注释和分析工具，以探索eccDNA Altas中现有的eccDNA或用户自定义的eccDNA，包括癌基因、典型增强子、超级增强子、CTCF结合位点、SNPs、染色质可及性、eQTLs、基因表达、存活和基因组可视化。总之，eccDNA Atlas 提供了一个集成的 eccDNA 数据仓库，是未来研究的重要工具。

数据库示例

方法类

1、单细胞多组学测序方法scGTP-seq

文章标题：Single-cell third-generation sequencing-based multi-omics uncovers gene expression changes governed by ecDNA and structural variants in cancer cells

发表期刊：Clinical and Translational Medicine（IF=10.6）

文章链接：https://doi.org/10.1002/ctm2.1351

癌细胞往往表现出大规模的基因组变异，如染色体外环状DNA ( ecDNA )和结构变异体( SVs )，这些变异与癌症的起始和进展高度相关。目前，还没有足够的方法来揭示这些变异如何在单细胞水平上调节异质性癌细胞群体中的基因表达。研究人员开发了一种单细胞多组学测序方法scGTP-seq，利用长读长测序技术分析ecDNA和SVs。研究人员证明了该方法可以有效地检测ecDNA和SVs，并说明了这些变化如何影响各种细胞系中的转录组变化。最后在肝细胞癌( HCC )临床样本中应用并验证了该方法，证明了该方法的可行性。

测序方法示意图

2、单细胞eccDNA和转录组的同时测序方法（scEC&T-seq）

文章标题：Parallel sequencing of extrachromosomal circular DNAs and transcriptomes in single cancer cells

发表期刊：Nature Genetics（IF=30.8）

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41588-023-01386-y

肿瘤染色体外DNA (etrachromosomal DNA，ecDNA )在肿瘤中普遍存在，但其起源、结构动力学以及对肿瘤内异质性的影响仍有许多问题尚未解决。本研究中作者描述了一种从单细胞中并行测序环状DNA和全长mRNA的方法，单细胞染色体外环状DNA和转录组测序(scEC&T-seq)。通过将scEC&T-seq应用于癌细胞，作者描述了细胞间ecDNA含量的差异，同时研究了它们的结构异质性和转录影响。含有癌基因的ecDNA克隆性地存在于癌细胞中，并驱动细胞间癌基因的表达差异。相比之下，其他小环状DNA仅存在于单个细胞中，表明它们在选择和繁殖方面存在差异。ecDNA结构的细胞间差异表明环状重组是ecDNA进化的一种机制。这些结果表明，scEC&T-seq是一种系统地表征癌细胞中小环状和大环状DNA的方法，这将有助于分析这些DNA元件在癌症和其他方面的作用。

scEC&T-seq方法示意图

小结

随着环状DNA测序技术的逐渐成熟，新的测序方法、数据库等不断涌现，eccDNA的产生机制、作用机理也在不断被探索。通过对今年环状DNA高分文章总结，我们不难发现，疾病相关研究仍然是环状DNA研究的重要领域，环状DNA不仅仅可以作为一种新型特异的肿瘤标志物，还在肿瘤发生发展机理研究中发挥重大的潜在价值。目前，相关研究已经表明eccDNA在衰老、肿瘤、耐药、凋亡等方面的强大调控功能。但我们对eccDNA的功能认知还是初步的，其在生理和病理条件下对基因的调控机制、免疫调节等方面仍待研究。因此未来对eccDNA功能机制的深入探索也将会继续成为科研热点，这也正是您加入eccDNA研究领域的极佳时机！快来和云序生物一起在环状DNA领域大展拳脚吧！

云序生物eccDNA测序

云序生物是国内率先提供环状DNA测序服务的公司，早在2018年已启动了环状DNA测序技术的开发。2019年，云序发布了组织细胞环状 DNA 测序（circle-seq），并成为A&A Bio独家代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用）。2020年，云序又相继发布了体液样品环状DNA测序及体液样品环状DNA甲基化测序服务，拥有丰富的环状DNA测序产品线。云序生物环状DNA测序采用双端测序，上机测序数据量24G。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状DNA测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。 2021年，云序生物的客户发表国内首批 eccDNA 研究论文，其中更有发表于 Nature Communications 上的高分研究。

云序生物eccDNA相关产品

环状DNA Sanger 测序验证

A&A Biotechnology 环状DNA 纯化柱

1.组织细胞环状DNA测序

云序生物基于circle-seq的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状DNA，再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程，本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。

技术优势：

使用原装A&A Biotechnology纯化柱高效富集环状DNA

滚环扩增放大环状DNA信号，提高检出率

专业的生信分析：详尽的注释、丰富的图表

云序生物eccDNA测序实验示意图

2.体液样品环状DNA测序

针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开eccDNA环状结构并同时在DNA片段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量，使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。

技术优势：

减少DNA损失

保留原始表达量，不同环状DNA间表达量比较更准确

3.体液样品环状DNA甲基化测序

针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序参考卢煜明教授团队 2021 年研发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开环状DNA环状结构并同时在DNA片段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的C转化为U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。