目前Monocle是scRNA-seq拟时序分析的经典工具，使用最广泛的是Monocle2。Monocle2 通过反向图嵌入(Reversed Graph Embedding) 技巧学习细胞轨迹的主要结构，然后对细胞进行排序，能较为准确地解释复杂的生物学过程。

接下来，让我们一起来看看运用monocle2的拟时序分析在文献中的运用吧！

案例分析

案例一

研究概况
胰腺导管癌（PDAC）是最常见的胰腺癌，具有高度肿瘤内异质性和不良预后特征。为了全面描述PDAC的肿瘤内异质性和PDAC进展的潜在机制，协和医院的研究人员采用单细胞测序技术获得了来自原发性PDAC肿瘤和对照组胰腺的57,530个胰腺细胞的转录组图谱，并确定了不同的恶性细胞和基质细胞类型，包括分别具有异常和恶性的基因表达谱的两种导管亚型。作者发现异质的恶性亚型由几个具有不同的增殖和迁移潜力的亚群组成。

样本信息
实验组：24个PDAC肿瘤样本（41,986个细胞）
对照组：11个未经处理的胰腺样本（15,544个细胞）

研究过程及结果（着重解读拟时序分析）
为了探索肿瘤的细胞组成，作者进行了分群并在t-SNE降维结果上进行展示，确定了10个主要细胞群，包括1型导管细胞（type 1 ductal），2型导管细胞（type 2 ductal），腺泡细胞（acinar），内分泌细胞（endocrine），内皮细胞（endothelial），成纤维细胞（fibroblast），星状细胞（stellate），巨噬细胞（macrophage），T细胞和B细胞 （T and B cells）（图1a）

作者接下来检测了两种导管细胞的基因表达模式，MUC1标志物可以用来区分具有异常基因表达谱的1型导管细胞和恶化程度较高的2型导管细胞，其中1型导管细胞分为两个不同的亚组 (图1b)，第一个亚组显示出较低的MUC1表达，第二个亚组显示出较高的MUC1表达（表现出一些2型恶性导管细胞的特征）（图1c）。

图1.细胞分群

(a) t-SNE图揭示PDAC中的主要细胞类型
(b) t-SNE展示1型导管细胞的2个亚组
(c) 小提琴图展示正常导管细胞的标记物（AMBP）和肿瘤导管细胞的标记物（MUC1）在两个亚组中的表达水平

作者对基因表达图谱异常的1型导管细胞和恶性化程度较高的2型导管细胞进行了拟时序分析。图2a揭示了低表达MUC1的1型导管细胞经过高表达MUC1的1型导管细胞的过渡发展为恶性化程度较高的2型导管细胞。沿着PDAC进展的轨迹，作者进一步分析了所有基因的表达模式。作者将这些基因聚类为4个异常表达模式和4个恶性模式。大部分负责细胞增殖和迁移的基因在肿瘤进展的晚期被明显激活（图2b）。作者同样检测到了多个参与PDACs肿瘤发生的关键调控因子和转录因子的激活，包括几个可能与PDAC进展相关的基因，如PI3K-Akt通路激活剂YWHAZ（图2c）。也就是说，细胞轨迹的分析揭示了多种肿瘤相关的通路和转录因子在PDAC的进展过程中差异性地表达

图2.恶性肿瘤发展过程中的差异基因表达谱

(a) 由Monocle2推断的有异常基因表达谱的导管细胞和恶性导管细胞的伪时间。每个点对应一个细胞。不同颜色代表不同细胞类型；
(b) 随着伪时间差异表达的基因被分层聚类为八个模式，每个剖面的代表性基因功能和通路如图所示；
(c) 热图展示了参与PDAC进展的代表性基因的表达。从蓝色到红色表示从低到高的相对表达水平；
(d) 热图展示了编码参与PDACs肿瘤发生的关键调控因子和转录因子的基因的表达。从蓝色到红色表示从低到高的相对表达水平。

案例二

研究概况
为了研究免疫细胞对骨髓基质细胞和骨骼稳态的调控，华西医院的研究人员对小鼠下颚牙槽骨样本进行了scRNA-seq，揭示了巨噬细胞是与颅面骨髓间充质干细胞（MSCs）相互作用的最大细胞群。与长骨骨髓（LBM）相比，活化的巨噬细胞亚群在肺泡骨髓（ABM）中的比例更高，并且这个亚群是分泌细胞因子Oncostatin M（Osm）的主要群体。ABM巨噬细胞调理的培养基能通过依赖细胞因子Osm的通路更有效地促进成骨分化和抑制MSCs的成脂分化。

样本信息
8只12周大的雄性C57BL/6J野生型小鼠下颚牙槽骨样本

研究过程及结果 （着重解读拟时序分析）
通过单细胞测序获得了总共10224个细胞。根据典型的细胞表面标记，作者确定了12个细胞群，包括中性粒细胞（neutrophil），髓系祖细胞（myeloid progenitor），巨噬细胞（macrophage），树突状细胞（dendritic cell）, B细胞（B cell），原B细胞（pro-B cell），T细胞（T cell）, 自然杀伤细胞（natural killer cell），巨核细胞（megakaryocyte），红细胞（erythrocyte），造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell/HSPC），间质细胞（mesenchymal cell）（图3）。

图3.用UMAP对scRNA-seq鉴定的细胞进行的可视化。不同的细胞群被定义并以颜色区分。每个点代表一个独立的细胞。

接下来，作者用CellPhoneDB2进行了细胞通讯分析，发现巨噬细胞和骨髓间充质干细胞之间存在着密切的互动。通过进一步探索巨噬细胞的异质性，巨噬细胞群被分为四个亚群 （图4a）。其中亚群0和1普遍的标志物基因有Csf1r, Cd68和 Cd14。亚群1高表达极化巨噬细胞的标志物基因，如Stat1, Il1b和 Ccr2。亚群2高表达交替活化巨噬细胞的标志物基因Adgre1, Mrc1 and Cd209f（图4b）。通过GO富集分析，发现亚群3的生物功能富集在细胞分裂，DNA复制和细胞增殖相关的通路，是巨噬细胞主要的增殖群体。亚群0，1，2是具有不同功能的成熟的巨噬细胞群体。亚群0富集于吞噬功能和抗原呈现，亚群1与细胞因子的分泌，细菌和细胞内病原体的免疫反应有关，亚群2表现交替活化巨噬细胞的特征如伤口愈合和血管形成的调节（图4c）。

图4.巨噬细胞亚分群情况

（a）巨噬细胞的四个亚群可视化
（b）巨噬细胞群中经典巨噬细胞极化标志物的表达情况
（c）巨噬细胞不同亚群的生物功能GO富集分析

接下来，作者进行了拟时序分析。基于巨噬细胞的基因表达动态，作者构建了一棵伪时间发育树，并确定了两个独立的分支点 （图5a）。这4个巨噬细胞亚群散布在发育树的不同分支处。亚群3位于发育树的起点，表明是其他亚群的发育起源。这一观察结果与之前GO富集的结果（亚群3作为一个增殖群体）一致。亚群0和1位于两个不同的分支，亚群2分布更为广泛，部分与亚群0和1重叠（图5b）。随伪时间分布的基因表达模式表明Cd68和Csf1r（普遍的标志物基因）的表达曲线相对平稳。伴随着Cd68和Csf1r （亚群0和1的maker gene）表达量的减少，Apoe和Adgre1 （亚群2的marker gene）表达量增加。Mki67和Pcna的表达只在亚群3中上调（图5c）。如图5d所示，在两个分支中具有最显著变化的且表达模式相似的基因被聚到了一类。

图5.巨噬细胞群的拟时序分析

(a) 按伪时间值排列的巨噬细胞群的轨迹顺序。每个点对应一个细胞，颜色越深表示伪时间值（离根节点的距离）越小；
(b) 巨噬细胞亚群在发育树上的集群分布。不同颜色代表不同细胞亚群；
(c) 巨噬细胞不同亚群的标志物基因随伪时间的表达；
(d) 两个轨迹分支点上的差异基因的聚类热图。（横坐标为伪时间，中间的白色竖条代表时间最早的细胞，竖条左右两边分别代表两个Lineage上的时间点，热图的最左边和最右边分别代表这两个Lineage上时间最晚的细胞，上方红色、灰色、蓝色的色条分别表示第一条 Lineage 特有的时间部分，两条 Lineage 共有的时间部分，即两条Lineage共同的祖先细胞，第二条Lineage特有的时间部分。纵坐标为基因，热图中的每一格表示该基因在该伪时间点的平均表达量scale后的值，颜色越蓝，表达量越低，颜色越红，表达量越高，左边的树为基因的层次聚类树，不同色条表示该基因在层次聚类方法的划分下所属的 cluster）。

结 语

通过以上两个案例，我们可以发现拟时序分析可以帮助了解细胞发育的轨迹以及过渡细胞类型，也可以展示在发育或分化节点起关键作用的核心基因在细胞进展过程中的表达情况，这些都为后续的分析奠定了一定的基础。希望这次分享的运用monocle2进行拟时序分析的文献能为老师们提供一些启发。

【参考文献】
1.Peng, J., Sun, B. F., Chen, C. Y., Zhou, J. Y., Chen, Y. S., Chen, H., Liu, L., Huang, D., Jiang, J., Cui, G. S., Yang, Y., Wang, W., Guo, D., Dai, M., Guo, J., Zhang, T., Liao, Q., Liu, Y., Zhao, Y. L., Han, D. L., … Wu, W. (2019). Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell research, 29(9), 725–738. https://doi.org/10.1038/s41422-019-0195-y
2.Lin, W., Li, Q., Zhang, D., Zhang, X., Qi, X., Wang, Q., Chen, Y., Liu, C., Li, H., Zhang, S., Wang, Y., Shao, B., Zhang, L., & Yuan, Q. (2021). Mapping the immune microenvironment for mandibular alveolar bone homeostasis at single-cell resolution. Bone research, 9(1), 17. https://doi.org/10.1038/s41413-021-00141-5