New Phytol.(IF=8.1)｜安农大宋传奎教授团队最新研究刷新认知！甜菜碱竟能“解锁”茶树抗寒密码？
英文标题：Glycoside-specific metabolomics reveals the novel mechanism of glycinebetaine-induced cold tolerance by regulating apigenin glycosylation in tea plants
中文标题：糖苷特异性代谢组学揭示了甜菜碱通过调节芹菜素糖基化诱导茶树抗寒的新机制
发表期刊：New Phytologist
影响因子：8.1
研究背景
茶树(Camellia sinensis)因其丰富的次生变质岩而被公认为世界上最重要的经济作物之一，主要生长在温暖潮湿的热带和亚热带地区。但近年来，全球气候变化导致早春冷害和冻害频发，明显制约了其生长发育和生态分布，从而阻碍了茶业的可持续发展。当植物经历冷胁迫时，它们的代谢物发生修饰，包括甲基化和糖基化，这在调节溶解度、稳定性、以及各种次生代谢物的生物活性，这与植物对冷胁迫的耐受性有着复杂的联系。糖基化是胁迫下影响次生代谢产物的关键修饰，受甘氨酸甜菜碱(Glycinebetaine, GB)影响，调控植物的抗逆性。然而，糖苷的复杂性和检测挑战阻碍了应激下其与GB代谢相互作用的调节机制的理解。
近期，安徽农业大学宋传奎教授团队在New Phytologist上发表了题为"Glycoside-specific metabolomics reveals the novel mechanism of glycinebetaine-induced cold tolerance by regulating apigenin glycosylation in tea plants"的研究论文。该研究开发了一种利用锥孔电压诱导源内裂解的糖苷特异性代谢组学方法，揭示了GB通过调节芹菜素糖苷化诱导茶树耐寒性的新机制，拓宽了对糖苷化在植物抗寒作用的理解。
研究结果
茶树糖苷特异性代谢组学方法的建立
糖基化导致代谢物底物分子量增加，当应用CV诱导源内解离时，糖苷在底物和糖苷修饰基团之间的键处发生解离。随后，采用高分辨率质谱分析仪同时检测糖苷的前体离子和片段离子（即苷元），从而产生特定的NL值（图1a-c）。基于这一原理，本研究首先通过标准品确定了能诱导糖苷源内解离的初始CV。研究发现，当CV从40V增加到50V时，前体离子及其二聚体对两种标准样品的响应值均略有增加，这表明较高的CV有利于更多离子的进入（图1d）。然而，还观察到苷元离子和其他片段的响应值显著增加，表明这两种苷在CV=50V时开始进行源内解离。山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮苷和牡荆素-2-O-鼠李糖苷的键解离模式与槲皮素7-O-葡萄糖苷非常相似(图1e)。因此，推断CV=40V代表糖苷源内解离的阈值。在确定初始CV之后，进一步研究了茶树中糖苷源内解离最大化的CV范围。因此，在 50、60、70、80和90V的CV下观察四种标准品的键解离模式，以确定最适CV范围。结果表明，当CV从40V增加到70V时，槲皮素7-O-葡萄糖苷的响应略有增加，而其二聚体的响应略有下降。将CV从70增加到90V，槲皮素7-O-葡萄糖苷的响应相对稳定，而其二聚体的响应明显下降。同时，还观察到大量苷元离子的产生(M-H-NL=301.0374)，表明在此CV范围内，糖苷发生了相当大的源内解离，二聚体的解离有助于前体离子的产生，从而稳定了槲皮素7-O-葡萄糖苷的响应值（图1d）。山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮苷和牡荆素-2-O-鼠李糖苷的键解离模式与槲皮素7-O-葡萄糖苷的键解离模式非常相似(图1e)，表明这两种标准物在该CV范围内都发生了相当大的源内解离。因此，本实验的CV范围被确定为40-90V。综上，本实验设定初始CV为40V，并在该电压下对单个样品进行常规全局代谢分析。CV范围确定为40-90V，且以5V为增量进行梯度设置。
图1 茶树糖苷特异性代谢组学策略
用CsBADH1评价糖苷特异性代谢组学方法的效率
通过鉴定显著差异代谢物来评估苷特异性代谢组学的效率，并利用该方法阐明冷响应基因CsBADH1对茶树糖苷的调控作用。结果显示，常规全局代谢组学分析从茶苗提取物中检测到超过4000种独特的可量化代谢物特征。具体而言，在ESI+模式下鉴定出2147个特征，在ESI-模式下鉴定出1941个特征（图2a）。对CsBADH1沉默和对照茶苗的代谢谱进行单变量分析，发现超过1000个代谢物特征，与之形成鲜明对比的是，糖苷特异性代谢分析仅鉴定出不到200个糖苷离子，其中ESI+模式下有65个，ESI-模式下有124个（图2b）。单因素分析表明，CsBADH1沉默的茶苗中70个糖苷离子的水平发生显著变化。在CsBADH1沉默的茶树中，预计发生显著变化的70个糖苷离子包括28个单糖苷、21个双糖苷和21个三糖苷（图2b）。这些结果表明，苷特异性代谢组学分析可同时鉴定具有不同糖数量和糖类型的多种糖苷。当对同一化合物进行不同糖苷修饰的重复计数时，候选糖苷离子的总数减少到60个。因此，与传统的全局代谢组学相比，糖苷特异性代谢分析大大减少了未知代谢物的数量，并将目标离子范围缩小了94.3%。在源内解离过程中，具有特定分子量的代谢物的糖基化可以通过中性丢失(NL)途径消除，从而产生独特的NL模式。G1的中性丢失为m/z=162.0424(Δ=0.104)，表明其发生了糖基化（图1c）。根据MS/MS谱图，从先前鉴定并确认为糖苷的60个候选离子中选择了15个糖苷离子（图2c）。在这15个糖苷离子中，9个为单糖基化，包括葡萄糖基化/半乳糖基化、鼠李糖基化以及阿拉伯糖基化/木糖基化。
图2 通过CV诱导源内解离准确表征茶树中的糖苷
CsBADH1通过调节冷响应性糖苷来调节耐寒性
为了研究CsBADH1在低温胁迫下茶树中的可能作用，分析了4℃低温驯化0、1、3、5和7d茶树中CsBADH1基因的表达水平和相对GB含量。CsBADH1的表达水平在4℃下显著上调，并随冷暴露时间持续上调。相应地，GB含量也呈现相似趋势（图3a）。这些结果表明，CsBADH1可能参与茶树的GB生物合成和冷胁迫响应。为了进一步研究CsBADH1在茶树中的功能，我们首先获得了纯化的BADH酶，并通过合适的酶催化反应体系，在体外确定了其诱导GB合成的功能（图3b）。随后，用CsBADH1沉默的茶树进行耐冷性测定。结果表明，CsBADH1沉默植株对冷胁迫表现出显著的敏感性表型，CsBADH1表达量和GB含量显著降低(图3c-e)。叶片光合活性显著低于非沉默植株，FV/FM值也显著降低(图3f)。这些结果表明，CsBADH1参与GB的生物合成，并积极调节茶树的耐寒性。紧接着，对因CsBADH1沉默而发生显著变化的糖苷与低温诱导发生显著变化的化合物进行了相关性分析。取两者的交集，共筛选出9个同时受CsBADH1和低温诱导变化的苷类化合物(图3g)。其中，一个糖苷离子(m/z=579.1708)在CsBADH1沉默植株中比非沉默植株显著上调，且在低温处理植株中与室温对照植株相比也呈显著上调趋势。其中，一个糖苷离子(m/z=579.1708)在CsBADH1沉默植株中比非沉默植株显著上调，且在低温处理植株中与室温对照植株相比也呈显著上调趋势。然后通过将糖苷离子与假定的糖苷标准物进行比较，确定糖苷离子为异野漆树苷(图3h)。色谱图进一步表明，与非沉默组相比，沉默CsBADH1导致茶树中异野漆树苷含量显著增加(图3i)。最后，对茶叶进行外源GB喷施处理，结果表明，喷施GB后，茶树内源GB含量显著增加，异野漆树苷含量呈下降趋势(图3j-k)。总体而言，CsBADH1可以上调GB水平，下调异野漆树苷水平，同时正向调节茶树的耐寒性
图3 发现同时对甜菜碱醛脱氢酶(CsBADH1)和冷反应的糖苷
CsBADH1介导的冷响应糖苷、异野漆树苷及其前体芹菜素在茶树耐寒性中的作用
为了研究鉴定到的糖苷在寒冷胁迫下茶树中的潜在作用，首先确定了异野漆树苷及其前体芹菜素对寒冷的响应模式。DESI-MS分析结果直观地显示，冷处理后，芹菜素和异野漆树苷的离子响应值呈现明显上升趋势(图4a)，说明两者均为冷反应代谢物。随后，为了进一步阐明两者对低温的反应，对茶树进行了外源喷洒异野漆树苷及其前体芹菜素和耐寒性实验。结果显示，喷施异野漆树苷导致内源异野漆树苷在茶叶中积累，导致茶叶出现冷敏表型，FV/FM值显著降低(图4b-d)。喷施芹菜素能显著提高茶树内源芹菜素水平(图4e)，但对茶树的表型没有显著影响，略微提高FV/FM值(图4b-c)，表明芹菜素正向调控茶树的耐冷性。为了进一步证明芹菜素在低温胁迫下对茶树的作用，对芹菜素合成的关键基因FNS进行了基因沉默处理，然后进行了耐寒性试验。结果显示，FNS沉默植株对冷胁迫表现出明显的敏感性表型，FNS表达水平和芹菜素含量显著降低(图4f-h)。叶片光合活性显著低于非沉默植株，FV/FM值显著降低(图4i)。这些结果表明，FNS介导的芹菜素生物合成对茶树的耐寒性有积极的调节作用。
图4 异野漆树苷及其前体芹菜素在茶树耐寒性中的作用
GB和芹菜素通过减轻ROS损伤增强冷胁迫耐受性
已有研究表明，GB和芹菜素具有一定的抗氧化作用，能够清除自由基和活性氧(ROS)，且与植物的胁迫耐受性相关。在此基础上，进一步验证了GB、芹菜素和异野漆树苷是否能通过清除ROS和增强抗氧化活性来提高茶树的耐寒性。结果显示，CsBADH1沉默植株对冷胁迫表现出显著的敏感表型，O₂⁻和MDA含量显著增加，而总抗氧化能力(T-AOC)显著降低（图5a），表明GB可通过清除ROS和增强抗氧化活性来提高茶树的耐冷性。芹菜素和异野漆树苷喷施实验结果显示，喷施异野漆树苷可导致H₂O₂和O₂⁻积累，而喷施芹菜素显著减少H₂O₂积累，并提高T-AOC(图5b)。这表明芹菜素可以通过清除ROS和增强抗氧化活性来提高茶树的耐寒性，而异野漆树苷则不具有这一功能。FNS沉默实验显示，FNS沉默植株中H₂O₂和O₂⁻的积累显著增加，同时T-AOC显著降低，并伴随MDA积累，这也支持上述结论（图5c）。
图5 甜菜碱(GB)、异野漆树苷及其前体芹菜素对低温胁迫下茶树活性氧清除和抗氧化活性的影响
研究结论
本研究建立的苷特异性代谢组学方法为植物糖苷检测及相关代谢研究提供了高效工具，可扩展用于其他代谢物修饰分析。并且首次揭示GB通过调控芹菜素糖基化介导茶树耐冷性的机制，拓宽了对植物次生代谢（尤其是糖基化）在耐冷性中作用的认知。为茶树耐冷品种培育、低温防控技术研发提供理论依据，GB和芹菜素有望作为绿色调节剂应用于农业生产。
甜菜碱（GB）通过调节芹菜素糖基化诱导耐寒的新机制
END
Tang 撰文
Weyne 校稿